1.分光光度法定義與應(yīng)用
　　
　　1.1定義:分光光度法是利用物質(zhì)所*的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的分析檢測(cè)技術(shù).
　　
　　1.2特點(diǎn):靈敏,,快速和簡(jiǎn)便,在復(fù)雜組分系統(tǒng)中,不需要分離,即能檢測(cè)出其中所含的極少量物質(zhì).
　　
　　1.3應(yīng)用:生物<>化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質(zhì),核酸,酶等的快速定量檢測(cè).
　　
　　2.分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理
　　
　　2.1分光光度計(jì)的分類(lèi)
　　
　　2.2分光光度計(jì)工作原理
　　
　　2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)
　　
　　2.4分光光度法的測(cè)量誤差
　　
　　2.5顯色反應(yīng)及其影響因素
　　
　　2.1分光光度計(jì)的分類(lèi)
　　
　　分光光度計(jì)的分類(lèi)
　　
　　紅外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)
　　
　　可見(jiàn)光分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)
　　
　　紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)
　　
　　2.2分光光度計(jì)工作原理
　　
　　人眼可見(jiàn)的光只占電磁波譜的很小—部分（400~760nm）
　　
　　它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率zui小的無(wú)線(xiàn)電波到頻率zui大的γ-射線(xiàn)排成一列,即組成電磁波的波譜,
　　
　　2.2.1分光光度計(jì)的光譜范圍
　　
　　包括波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
　　
　　鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜,光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍(lán),靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源.
　　
　　氫燈的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400nm波長(zhǎng)的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.
　　
　　2.2.2物質(zhì)的吸收光譜（1）
　　
　　如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線(xiàn),即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為該溶液的吸收光譜.
　　
　　不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).
　　
　　2.2.2物質(zhì)的吸收光譜（2）
　　
　　當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過(guò)溶液.
　　
　　入射光=反射光+分散光+吸收光+透過(guò)光
　　
　　如果我們用蒸餾水（或組成此溶液的溶劑）作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
　　
　　入射光=吸收光十透過(guò)光
　　
　　2.2.3物質(zhì)吸光度（A）與透射比（T）的關(guān)系
　　
　　設(shè)I0為經(jīng)過(guò)空白校正后入射光的強(qiáng)度;I為透過(guò)光的強(qiáng)度.
　　
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知I=I0?10-εcl
　　
　　式中,c表示吸收物質(zhì)的摩爾濃度;l表示吸收物質(zhì)的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質(zhì)的摩爾消光系數(shù),它表示物質(zhì)對(duì)光的吸收特性,不同物質(zhì)的ε數(shù)值不同.所以I/I0=10-εcl
　　
　　令T（透射比）=I/I0T=10-εcl
　　
　　若以T對(duì)吸收物質(zhì)的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線(xiàn).
　　
　　由上式可得1g（1/T）=εcl
　　
　　lg（l/T）為物質(zhì)的吸光度（A）A=1g（1/T）
　　
　　2.2.4Lambert-Beer定律（E=εcl）
　　
　　上式說(shuō)明了物質(zhì)的吸光度與吸收物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer（朗伯-比耳）定律.
　　
　　2.3分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)
　　
　　無(wú)論哪一類(lèi)分光光度計(jì)都包括:光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表.分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:
　　
　　5個(gè)基本部件
　　
　　分光光度計(jì)的基本部件（1）:
　　
　　光源:分光光度計(jì)上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見(jiàn)光區(qū),近紫外光區(qū)和近紅外光區(qū)常用鎢絲燈作為光源;在紫外光區(qū)多使用氫弧燈.
　　
　　單色器:把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置.在分光光度計(jì)中多用作為色散元件.
　　
　　吸收池比色杯,比色皿,比色池）一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來(lái)盛被測(cè)的溶液.在低于350nm的紫外光區(qū)工作時(shí),必須采用石英池或熔凝石英池.
　　
　　分光光度計(jì)的基本部件（2）:
　　
　　吸收池（比色皿）必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質(zhì)料,厚度應(yīng)*相同,以免產(chǎn)生誤差.比色皿上的指紋,油污或壁上的沉積物都會(huì)顯著地影響其透光性,因此在使用前務(wù)必*清洗.
　　
　　常用光電池,光電管和光電倍增管三種.
　　
　　測(cè)量裝置—般常用的紫外光和可見(jiàn)光分光光度計(jì)有3種測(cè)量裝置,即電流表,記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元.現(xiàn)代的儀器常附有自動(dòng)記錄器,可自動(dòng)描出吸收曲線(xiàn).
　　
　　檢測(cè)器
　　
　　棱鏡與光柵
　　
　　棱鏡:光波通過(guò)棱鏡時(shí),不同波長(zhǎng)的光折射率不同;因而能將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi).玻璃對(duì)紫外線(xiàn)的吸收力強(qiáng),故玻璃棱鏡多用于可見(jiàn)光分光光度計(jì).石英棱鏡可在整個(gè)紫外光區(qū)傳播光,故在紫外光分光光度計(jì)中廣為應(yīng)用.
　　
　　衍射光柵:在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(xiàn)（每英寸約刻15000—30000條）.由于刻線(xiàn)處不透光,通過(guò)光的干涉和衍射使較長(zhǎng)的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
　　
　　棱鏡單色器裝置示意圖
　　
　　光源照到棱鏡（或光柵）以前,先要經(jīng)過(guò)一個(gè)入射狹縫,再通過(guò)平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過(guò)棱鏡的光再經(jīng)另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內(nèi)可得一清楚的光譜圖.如在焦線(xiàn)處放—出射狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡使光譜移動(dòng),就可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個(gè)裝置稱(chēng)為"單色器"
　　
　　檢測(cè)器---光電池
　　
　　光電池裝在一個(gè)特制的匣子里面由3層物質(zhì)組成的圓形或長(zhǎng)方形薄片.*層是一種導(dǎo)電性良好的金屬,這是光電池的負(fù)極.中間極薄的一層是半導(dǎo)體硒,第3層是鐵,這是光電池的正極.當(dāng)光電池受光照射以后,半導(dǎo)體硒的表面逸出電子,這些電子只向負(fù)極方向移動(dòng),而不向正極移動(dòng),因此在上下兩金屬片間產(chǎn)生一個(gè)電位差,線(xiàn)路連通時(shí)即產(chǎn)生電流
　　
　　檢測(cè)器---光電管
　　
　　光電管光電管是由封裝在真空透明封套里的一個(gè)半圓柱型陰極和一個(gè)絲陽(yáng)極組成.陰極的凹畫(huà)上有一層光電發(fā)射材料,此種物質(zhì)經(jīng)光照射可發(fā)射電子.當(dāng)在兩極間加有電位時(shí),發(fā)射出來(lái)的電子就流向絲陽(yáng)極而產(chǎn)生光電流.對(duì)于相同的輻射強(qiáng)度,它所產(chǎn)生的電流約為光電池所產(chǎn)生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產(chǎn)生的電流容易放大.
　　
　　檢測(cè)器---光電倍增管
　　
　　光電倍增管它比普通的光電管*,它可將*次發(fā)射出的電子數(shù)目放大到數(shù)百萬(wàn)倍.當(dāng)電子打在兼性陽(yáng)極上時(shí),能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個(gè)兼性陽(yáng)極所吸引,同樣再產(chǎn)生更多的電子.
　　
　　此過(guò)程重復(fù)9次后,每個(gè)光子可形成106~107個(gè)電子.這些電子zui后被收集在陽(yáng)極上.所得到的倍增電流可進(jìn)一步加以放大和測(cè)量.
　　
　　2.4分光光度法的測(cè)量誤差
　　
　　分光光度法的測(cè)量誤差
　　
　　選擇適宜波長(zhǎng)的入射光
　　
　　控制吸光度A的遍數(shù)范圍
　　
　　選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?br />　　
　　儀器測(cè)
　　
　　量誤差
　　
　　測(cè)量條
　　
　　件選擇
　　
　　2.4.1儀器測(cè)量誤差
　　
　　由朗伯-比爾定律可知,只有在一定的濃度范圍內(nèi),即一定的吸光度范圍同內(nèi),由分光光度計(jì)測(cè)量所引起的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差才是較小的;當(dāng)透光率接近0或1.0時(shí),其相對(duì)誤差趨于無(wú)限大;一般在百分透光率在10~80%的范圍內(nèi)（即吸光度在1~0.1）,濃度測(cè)量相對(duì)誤差較小;對(duì)于精密度高的儀器.當(dāng)吸度A=0.7-0.2時(shí)（百分透光率約為20-60%,測(cè)量誤差約為1%.
　　
　　2.4.2測(cè)量條件選擇
　　
　?。?）選擇適宜波長(zhǎng)的入射光:由于有色物質(zhì)對(duì)光有選擇性吸收,為了使測(cè)定結(jié)果有較高的靈敏度,必須選擇溶液zui大吸收波長(zhǎng)的入射光.
　　
　?。?）控制吸光度A的準(zhǔn)確的讀數(shù)范圍:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7讀數(shù)范圍內(nèi)時(shí),測(cè)量的準(zhǔn)確度較高.
　　
　?。?）選擇參比溶液:參比溶液是用來(lái)調(diào)節(jié)儀器工作零點(diǎn)的.若樣品溶液,試劑,顯色劑無(wú)無(wú)色可用蒸餾水作參比溶液;反之應(yīng)采用不加顯色劑的樣品液作參比溶液.
　　
　　2.5顯色反應(yīng)及其影響因素
　　
　　顯色反應(yīng)及其影響因素
　　
　　顯色反應(yīng)
　　
　　一般要求
　　
　　影響顯色
　　
　　反應(yīng)因素
　　
　　選擇性好
　　
　　靈敏度高
　　
　　生成的有色化合物性質(zhì)穩(wěn)定
　　
　　顯色劑與有色物顏色反差大
　　
　　顯色反應(yīng)要易于控制
　　
　　顯色劑用量
　　
　　反應(yīng)液的酸堿度（pH）
　　
　　反應(yīng)溫度
　　
　　顯色反應(yīng)時(shí)間
　　
　　干擾離子的影響
　　
　　2.5.1顯色反應(yīng)一般要求
　　
　　（1）選擇性好:顯色劑只與一種被測(cè)組分起顯色反應(yīng);
　　
　?。?）靈敏度高:靈敏度高有笪微量組分的測(cè)定;
　　
　?。?）有色化合物性質(zhì)穩(wěn)定:確保前后測(cè)定準(zhǔn)確.
　　
　　（4）顯色劑與有色物顏色反差大:兩者zui大吸收波長(zhǎng)之差應(yīng)大于60nm;
　　
　?。?）顯色反應(yīng)要易于控制:結(jié)果的確保實(shí)驗(yàn)再現(xiàn)性.
　　
　　2.5.2影響顯色反應(yīng)的主要因素
　　
　?。?）顯色劑用量:通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定zui適用量;
　　
　?。?）反應(yīng)液的酸堿度（pH）溶液酸堿度直接影響金屬離子與顯色劑存在形式以及有色化合物組成的穩(wěn)定性.
　　
　　（3）反應(yīng)溫度:不同的顯色反應(yīng)需要不同的反應(yīng)溫度,一般顯色反應(yīng)可在室溫下完成.
　　
　?。?）顯色反應(yīng)時(shí)間:顯色反應(yīng)的速度有快有慢.
　　
　　（5）干擾離子的影響:應(yīng)采用適當(dāng)方法消除其影響.
　　
　　3.7200型分光光度計(jì)的正確使用方法
　　
　　3.1結(jié)構(gòu)和工作原理
　　
　　3.1.1儀器結(jié)構(gòu)
　　
　　3.1.2工作原理
　　
　　3.1.3特點(diǎn)
　　
　　3.2使用方法
　　
　　3.3注意事項(xiàng)
　　
　　3.1.17200型分光光度計(jì)儀器結(jié)構(gòu)
　　
　　7200型光柵分光光度計(jì)由光源,單色器,試樣室,光電管,線(xiàn)性運(yùn)算放大器,對(duì)數(shù)運(yùn)算放大器及數(shù)字顯示器等部件組成,基本結(jié)構(gòu)如下圖所示.
　　
　　1.光源;2.單色器;3.試樣室;4.光電管;5.線(xiàn)性運(yùn)算放大器;6.對(duì)數(shù)運(yùn)算放大器;7.數(shù)字顯示器
　　
　　3.1.27200型分光光度計(jì)工作原理（圖）
　　
　　7200型光柵分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)示意圖
　　
　　1.光源燈;2.濾光片;3.球面反射鏡;4.入射狹縫;5.保護(hù)玻璃;6.平面反射鏡;7.準(zhǔn)直鏡;8.光柵;9.保護(hù)玻璃;10.出射狹縫;11.聚光鏡;12.試樣室;13.光門(mén);14.光電管;
　　
　　3.1.27200型分光光度計(jì)工作原理（文）
　　
　　由光源燈（1）發(fā)出連續(xù)輻射光線(xiàn),經(jīng)濾光片（2）和球面反射鏡（3）至單色器的入射狹縫（4）聚焦成像,光束通過(guò)入射狹縫（4）經(jīng)平面反射鏡（6）到準(zhǔn)直鏡（7）產(chǎn)生平行光,射至光柵（8）上色散后又以準(zhǔn)直鏡（7）聚焦在出射狹縫（10）上形成一連續(xù)光譜,由出射狹縫選擇射出一定波長(zhǎng)的單色光,經(jīng)聚光鏡（11）聚光后,通過(guò)試樣室（12）中的測(cè)試溶液部分吸收后,光經(jīng)光門(mén)（13）再照射到光電管（14）上.調(diào)整儀器,使透光度為100%,再移動(dòng)試樣架拉手,使同一單色光通過(guò)測(cè)試溶液后照射到光電管上.如果被測(cè)樣品有光吸收現(xiàn)象,光量減弱,由光電轉(zhuǎn)換元件將變化的光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),經(jīng)線(xiàn)性運(yùn)算放大器和對(duì)數(shù)運(yùn)算放大器處理,將光能的變化程度通過(guò)數(shù)字顯示器顯示出來(lái).可根據(jù)需要直接在數(shù)字顯示器上讀取透光度（T）,吸光度（A）或濃度（C）.
　　
　　3.1.3特點(diǎn)
　　
　?。?）具有低雜色光,高分辯率的單光束光路結(jié)構(gòu)的單色器;
　　
　　（2）具有良好的穩(wěn)定性,重現(xiàn)性和的測(cè)量讀數(shù);
　　
　?。?）明亮清晰的數(shù)字顯示器可顯示透射比,吸光度,濃度和所設(shè)置的波長(zhǎng),提高了儀器的讀數(shù)準(zhǔn)確性;
　　
　?。?）采用微機(jī)處理技術(shù),儀器具有自動(dòng)設(shè)置0%T和100%等控制功能;
　　
　?。?）儀器配有標(biāo)準(zhǔn)的RS-232雙向通訊接口,不僅可向計(jì)算機(jī)發(fā)送測(cè)試參數(shù),還可接收計(jì)算機(jī)發(fā)出的指令.
　　
　?。?）在已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度前提下,測(cè)定未知樣品濃度;
　　
　?。?）在已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度斜率前提下,測(cè)定未知樣品濃度.
　　
　　3.27200型分光光度計(jì)使用方法（基本操作1）
　　
　　3.2.1基本操作
　　
　?。?）通電---儀器自檢----預(yù)熱20min;
　　
　?。?）用鍵設(shè)置測(cè)試方式:透射比（T）,吸光度（A）,已知標(biāo)樣濃度方式（C）和已知標(biāo)樣濃度斜率（K）方式;
　　
　?。?）波長(zhǎng)選擇:用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng);
　　
　?。?）放樣順序:打開(kāi)樣品室蓋,在1~4號(hào)放置比色皿槽中,依次放入%T校具（黑體）,參比液,樣品液1和樣品液2.
　　
　?。?）校具（黑體）校"0.000":將%T校具（黑體）置入光路,在T方式下按"%T"鍵,此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示"0.000"
　　
　　（6）參比液校"100"%T或"0.000"A:將參比液拉入光路中,按"0A/100%T"鍵調(diào)0A/100%T,此時(shí)儀器顯示"BLA",表示儀器正在自動(dòng)校正,校正完畢后顯示"100"%T或"0.000"A后,表示校正完畢,可以進(jìn)行樣品測(cè)定.
　　
　?。?）樣品測(cè)定:將兩樣品液分別拉入光路中,此時(shí)若在"T"方式下則可依次顯示樣品的透射比（透光度）若在"A"方式下,則顯示測(cè)得的樣品吸光度.
　　
　　3.27200型分光光度計(jì)使用方法（濃度測(cè)定）
　　
　　7200型分光光度儀不僅可以測(cè)定未知樣品的透射比（T）和吸光度（A）這兩項(xiàng)基本操作,還可進(jìn)行未知樣品濃度測(cè)定.
　　
　?。?）在已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度前提下,測(cè)定未知樣品濃度.
　　
　?。?）在已知標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度斜率前提下,測(cè)定未知樣品濃度.
　　
　　備注:以上兩種濃度測(cè)定的方法請(qǐng)大家參照實(shí)驗(yàn)教學(xué)教材課后自學(xué).
　　
　　3.37200型光柵分光光度計(jì)的使用注意事項(xiàng)（1）
　　
　　（1）預(yù)熱是保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定的重要步驟.
　　
　?。?）比色皿的清潔程度,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.因此,特別要將比色皿清洗干凈.先用自來(lái)水將用過(guò)的比色皿反復(fù)沖洗,然后用蒸餾水淋洗,倒立于濾紙片上,待干后再收回比色皿盒中.必要時(shí),還要對(duì)比色皿進(jìn)行更精細(xì)的處理,如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡,沖洗.
　　
　　（3）比色皿與分光光度計(jì)應(yīng)配套使用,否則會(huì)引起較大的實(shí)驗(yàn)誤差.比色皿不能單個(gè)調(diào)換
　　
　　3.37200型光柵分光光度計(jì)的使用注意事項(xiàng)（2）
　　
　?。?）比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的2/3,過(guò)少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,過(guò)多易在測(cè)量過(guò)程中外溢,污染儀器.比色皿中試樣裝入量應(yīng)為2/3～3/4之間
　　
　?。?）拿放比色皿時(shí),應(yīng)持其"毛面",杜絕接觸光路通過(guò)的"光面".如比色皿外表面有液體,應(yīng)用綢布拭干,以保證光路通過(guò)時(shí)不受影響.
　　
　?。?）若待測(cè)液濃度過(guò)大,應(yīng)選用短光徑的比色皿,一般應(yīng)使吸光度讀數(shù)處于0.1～0.8范圍內(nèi)為宜.由于測(cè)定空白,標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)溶液時(shí)使用同樣光徑的比色皿,故不必考慮因光徑變化而引起的影響.
　　
　　4.UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)正確使用方法
　　
　　4.1紫外分光光度法概述
　　
　　4.2UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)和工作原理
　　
　　4.1.1儀器結(jié)構(gòu)
　　
　　4.1.2工作原理
　　
　　4.3UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用方法
　　
　　4.4UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)
　　
　　4.1紫外分光光度計(jì)法概述（1）
　　
　　4.1.1定義用紫外光源通過(guò)分光光度技術(shù)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的儀器叫作紫外分光光度計(jì).
　　
　　4.1.2原理因?yàn)樵S多化合物的分子結(jié)構(gòu)中存在共軛雙鍵,在200～400nm的紫外光區(qū)具有吸收光的特性,所以無(wú)需進(jìn)行顯色反應(yīng)便能直接測(cè)定.
　　
　　4.1.3應(yīng)用常用于對(duì)蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行定性,定量測(cè)定.蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基在波長(zhǎng)280nm處具有zui大吸收峰.故常用波長(zhǎng)280nm處的吸光度測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度.
　　
　　4.1.4特點(diǎn)
　　
　　（1）組成核酸的堿基也含有共軛雙鍵,其zui大吸收峰的波長(zhǎng)在260nm處.但在280nm處也有一定的光吸收,對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有一定的干擾作用.若分別測(cè)定280nm和260nm處的吸光度,可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式消除核酸對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響.
　　
　?。?）可對(duì)微量蛋白質(zhì)（1～10g/L）不需顯色,進(jìn)行直接定量測(cè)定.因此操作簡(jiǎn)便,而且可回收樣品.此外,鹽類(lèi)在280nm處無(wú)光吸收,少量鹽類(lèi)也不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果.
　　
　　（3）紫外分光光度法*符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它條件保持一致的情況下,被測(cè)溶液的吸光度與被測(cè)溶液的濃度成正比.
　　
　　4.2UV-754型分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和工作原理
　　
　　4.2.1儀器結(jié)構(gòu)由光源（鎢燈或氚燈）,單色器,試樣室,接受器（光電管）,微電流放大器,A/C轉(zhuǎn)換器,打印機(jī),鍵盤(pán)和顯示器等部件組成.微處理機(jī)（CPU）通過(guò)輸入,輸出口（I/O）對(duì)微電流放大器,顯示器和打印機(jī)等部件進(jìn)行控制,實(shí)現(xiàn)儀器的整體功能.
　　
　　4.2.2工作原理（圖）
　　
　　UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)示意圖
　　
　　1.氚燈;2.鎢燈;3.濾光鏡;4.聚光鏡;5.入射狹縫;6.平面;7.準(zhǔn)直鏡;8.光柵;9.出射狹縫;10.聚光鏡;11.試樣室;12.光門(mén);13.光電管
　　
　　4.2.2工作原理（文）
　　
　　由光源氚燈或鎢燈（1或2）發(fā)出連續(xù)輻射光線(xiàn)經(jīng)濾光鏡（3）和聚光鏡（4）至單色器入射狹縫（5）處聚焦成像,再經(jīng)平面反射鏡（6）反射至準(zhǔn)直鏡（7）產(chǎn)生平行光射至光柵（8）在光柵上色散后又經(jīng)準(zhǔn)直鏡（7）聚焦在出射狹縫（9）上成一連續(xù)光譜,經(jīng)出射狹縫射出的光在聚光鏡（10）聚光后分別通過(guò)試樣室（11）中的空白溶液（或?qū)φ杖芤海?標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液,被部分吸收后光經(jīng)光門(mén)（12）再照射到光電管（13）上.被光電管接收的光信號(hào)再被轉(zhuǎn)換成電信號(hào),后者通過(guò)輸入,輸出口（I/O）,見(jiàn)上圖.進(jìn)入微處理機(jī)進(jìn)行調(diào)零,變換對(duì)數(shù),濃度計(jì)算以及打印數(shù)據(jù)等處理,將檢測(cè)結(jié)果通過(guò)顯示器和打印系統(tǒng)顯示出來(lái).
　　
　　4.3UV-754型分光光度計(jì)使用方法（外型）
　　
　　4.3.1UV-754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的外觀(guān)圖
　　
　　1.試樣架拉手;2.鍵盤(pán)部分;3.數(shù)據(jù)打印;4.波長(zhǎng)刻度盤(pán);5.波長(zhǎng)手輪;6.電源汗關(guān);7.氚燈觸發(fā)按鈕;8.光源室.
　　
　　4.3UV-754型分光光度計(jì)使用方法（鍵盤(pán)）
　　
　　UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的鍵盤(pán)示意圖
　　
　　鍵盤(pán)詳細(xì)內(nèi)容說(shuō)明如下:
　　
　　4.3UV-754型分光光度計(jì)使用方法（鍵盤(pán)內(nèi)容1）
　　
　　①功能鍵:F1～F8,暫無(wú)功能,備擴(kuò)展使用.
　　
　?、赥鍵:具有三種透光度狀態(tài)調(diào)節(jié)功能.
　　
　?、跘/C鍵:吸光度/濃度轉(zhuǎn)換鍵,按此鍵可分別表示"吸光度0～3A","吸光度0～0.lA","吸光度0～0.1A"和"濃度"四種狀態(tài).
　　
　　④送入鍵:只在"A/C鍵"處于"濃度"狀態(tài)時(shí)才起作用.
　　
　?、荽蛴℃I:手動(dòng)方式時(shí)有效,每按一次,便打印一次數(shù)據(jù).
　　
　?、蘅刂奇I:在分別使用"設(shè)定+","設(shè)定一","倍率","顯示方式"和"打印方式"各鍵時(shí),需與控制鍵分別聯(lián)合使用才起作用.
　　
　?、咴O(shè)定+鍵:在"A/C鍵"處于"濃度"狀態(tài)時(shí)才能設(shè)定"標(biāo)準(zhǔn)濃度值","斜率K值"或"斜率B值"等數(shù)據(jù).其功能是將設(shè)定數(shù)值增加.
　　
　　4.3UV-754型分光光度計(jì)使用方法（鍵盤(pán)內(nèi)容2）
　　
　?、嘣O(shè)定-鍵:是使設(shè)定數(shù)值減小,操作與"設(shè)定+鍵"類(lèi)同.
　　
　?、岜堵舒I:用來(lái)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的放大倍數(shù).有"1","0.1"和"0.01"三檔,與"控制鍵"同時(shí)按下,倍率便發(fā)生相應(yīng)的變化.
　　
　?、怙@示方式鍵:可表示"積分","濃度"和"樣品號(hào)"三種狀態(tài).
　　
　?。?1）打印方式鍵:存在"自動(dòng)"（每移動(dòng)一次試樣架,儀器自動(dòng)打印一次數(shù)據(jù)）,"方式1"（手動(dòng)方式,每按一次此鍵,儀器打印一次數(shù)據(jù)）和"方式2"（每分鐘定時(shí)打印一次數(shù)據(jù)）三種狀態(tài).每與"控制鍵"同時(shí)按一次此鍵便改變一個(gè)狀態(tài).
　　
　　（12）送紙鍵:每按一次此鍵,儀器移動(dòng)一次打印紙.
　　
　?。?3）TAC:數(shù)字顯示器顯示測(cè)定結(jié)果或輸入的數(shù)據(jù).
　　
　　4.3.2UV-754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)使用方法（1）
　　
　　（1）測(cè)試準(zhǔn)備
　　
　?、賹⑹⒂?空白"或"對(duì)照"溶液的比色皿處于試樣室光路位置;
　　
　?、谶x擇波長(zhǎng)旋動(dòng)波長(zhǎng)手輪選定所需波長(zhǎng);
　　
　　③確定光源波長(zhǎng)在200～290nm時(shí),選擇氚燈為光源;波長(zhǎng)在290～360nm時(shí),同時(shí)以氚燈和鎢燈為光源;波長(zhǎng)在360～850nm時(shí),選擇鎢燈為光源;若使用氚燈,需按氚燈觸發(fā)按鈕啟動(dòng);
　　
　?、軆x器自檢顯示器顯示"754"后,數(shù)字顯示出現(xiàn)"100.0",表明儀器通過(guò)自檢程序,此時(shí)儀器進(jìn)入"0～100%","連續(xù)"和"自動(dòng)"狀態(tài)（打印系統(tǒng)處于自動(dòng)打印狀態(tài)）
　　
　?、輧x器預(yù)熱30min后方可進(jìn)行測(cè)試.
　　
　　4.3.2UV-754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)使用方法（2）
　　
　　（2）測(cè)試過(guò)程
　　
　　①數(shù)字顯示透光度"100.0"（或吸光度"0.00"）2～3s后,將盛有標(biāo)準(zhǔn)溶液的比色皿移至光路,打印系統(tǒng)便自動(dòng)打印出所得數(shù)據(jù);
　　
　?、趯⑹⒂袠悠啡芤旱谋壬笠浦凉饴?打印系統(tǒng)即自動(dòng)打印出該樣品的數(shù)據(jù).待*個(gè)樣品數(shù)據(jù)打印完畢后,將第二個(gè)樣品置于試樣室光路………,若有多個(gè)樣品,操作以此類(lèi)推.
　　
　?。?）打印方式
　　
　　采用"自動(dòng)"方式打印,依所選定表達(dá)方式可打印出以下數(shù)據(jù):No（編號(hào)）%T（透光度）或ABS（吸光度）或CONC（濃度）
　　
　　4.4UV—754型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)注意事項(xiàng)
　　
　　（1）預(yù)熱是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要步驟,不可忽略.
　　
　?。?）在波長(zhǎng)320nm以下的實(shí)驗(yàn)范圍一定要選用石英比色皿,絕不可以玻璃比色皿替代.
　　
　　（3）比色皿需保持清潔,拿放時(shí)要符合要求.
　　
　?。?）對(duì)不同型號(hào)和類(lèi)型的儀器要嚴(yán)格按照使用說(shuō)明操作.
　　
　　（5）UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)還可開(kāi)展"以校正線(xiàn)進(jìn)行濃度演算"和"用已知斜率K值與B值進(jìn)行濃度測(cè)定"等多種測(cè)試方法.
　　
　?。?）不同蛋白質(zhì)所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸的數(shù)量有所差異,此法對(duì)不同蛋白質(zhì)洋品的測(cè)定結(jié)果有所影響